میکروسکوپ

میکروسکوپ ابزاری است که می‌تواند تصاویر بزرگ شده از اشیا کوچک را تولید کند و به مشاهده‌گر اجازه می‌دهد نمای بسیار نزدیک از ساختار‌های بسیار کوچک را در مقیاس مناسب برای تحلیل و بررسی در اختیار داشته باشد.

یک میکروسکوپ نوری به همراه معرفی اجزای آن

کلمه «میکروسکوپ» (Microscope) از کلمه لاتین «میکروسکوپیوم» (Microscopium) گرفته شده است که از کلمات یونانی «میکروس» (Mikros) به معنی کوچک و «اسکوپین» (Skopein) به معنای نگاه کردن گرفته شده است.

مخترع

مشخص نیست که چه کسی اولین بار میکروسکوپ را اختراع کرده است. با این حال، به نظر می‌رسد که نخستین میکروسکوپ‌‌ها توسط بینایی‌سنج هلندی به نام «‌هانس جانسن» (Hans Janssen) و پسرش «زاخاریاس جانسن» (Zacharias Janssen) و سازنده ابزارهای مختلف مشاهده، فردی هلندی‌‌ به نام «هانس لیپرشی» (Hans Lippershey) (تلسکوپ را نیز اختراع کرد‌ه‌اند) ساخته شد‌ه‌اند.

انواع

میکروسکوپ‌­ها از نظر نوع آشکارگر به دو دسته­ اصلی تقسیم می­شوند:

• میکروسکوپ نوری
• میکروسکوپ فلوئورسنت
• میکروسکوپ اختلاف فاز
• میکروسکوپ تداخلی
• میکروسکوپ زمینه سیاه
• میکروسکوپ الکترونی
• میکروسکوپ الکترونی روبشی Scanning Electron Microscope
• میکروسکوپ الکترونی عبوری Transmission Electron Microscope

میکروسکوپ نوری (Optical Microscope)

• در این میکروسکوپ نور از پایین به بالا، از طریق یک لنز کندانسور به نمونه تابانده می شود.
• درنهایت از طریق لنز شیئی و لنز چشمی به چشم ما می رسد.
• نور توسط لنزهای شیشه ای متمرکز می شود.
• هر چقدر نمونه نور بیشتری را جذب کند، در تصویر تاریک تر دیده می شود؛
• بنابراین نمونه باید بسیار نازک و شفاف باشد.
• برای محاسبه بزرگ نمایی میکروسکوپ نوری، عدد روی لنز چشمی (که معمولاً 10 برابر است) را در بزرگ نمایی لنز شیئی ضرب می کنیم.
• اکثر لنزهای شیئی میکروسکوپ های نوری برای این که بتوانند تا حد امکان به نمونه خود نزدیک شوند، قابلیت چرخش دارند.

مزایا

• سهولت استفاده
• ارزان بودن
• نشان دادن رنگ ها
• قابلیت استفاده از نمونه زنده
• محدودیت های میکروسکوپ نوری
• به دلیل طول موج های نوری ضعیف، وضوح پایینی دارد؛
• به طوری که تنها قادر به تفکیک اجسام جدا از هم با فاصله دو میکرومتر است.
• بزرگ نمایی کمی دارند.

انواع میکروسکوپ‌های نوری

میکروسکوپ زمینه روشن (Bright Field Microscopy)

در این میکروسکوپ ساده‌ترین تکنیک نورپردازی به نمونه انجام می‌شود. در میکروسکوپ زمینه روشن، نور از زیر به نمونه برخورد می‌کند و تصویر آن از بالا مشاهده می‌شود. در تصاویر حاصل از این میکروسکوپ زمینه دارای نور سفید است و نواحی متراکم نمونه تیره دیده می‌شود.

میکروسکوپ زمینه تاریک (Dark Field Microscopy)

در این نوع میکروسکوپ نور از منبع نوری فقط به کناره‌های نمونه برخورد می‌کند، به همین دلیل نمونه به صورت روشن در زمینه تاریکی قابل مشاهده است و قدرت تفکیک این نوع میکروسکوپ از میکروسکوپ زمینه روشن بیشتر است و با استفاده از میکروسکوپ زمینه تاریک جزئیاتی بیشتری از نمونه قابل مشاهده می‌شود.

میکروسکوپ فاز کنتراست (Phase Contrast Microscopy)

میکروسکوپ فاز کنتراست یک نوع میکروسکوپ نوری است که تغییر فازها را در نور منتقل شده از طریق یک نمونه شفاف به تغییرات روشنایی در تصویر تبدیل می‌کند. تغییر فازها نامرئی هستند، اما وقتی به عنوان تغییرات روشنایی نشان داده ‌شوند، قابل مشاهده هستند. با استفاده از این تکنیک، کنتراست در نمونه‌های رنگ آمیزی نشده زیاد می‌شود، از این رو استفاده از میکروسکوپ فاز کنتراست برای مطالعه سلول‌های زنده و رنگ‌آمیزی نشده بسیار مناسب است.

میکروسکوپ فلورسانس (Fluorescence Microscopy)

نوع دیگری از میکروسکوپ نوری، میکروسکوپ فلورسانس است که برای تصویربرداری از نمونه‌‌هایی که فلورسانس دارند (یک طول موج نور را جذب می‌کند و طول موج دیگری را از خود ساطع می‌کنند) استفاده می‌شود. از منبع نور این میکروسکوپ با یک طول موج مشخص برای تحریک مولکول‌‌های فلورسنت موجود در نمونه استفاده می‌شود و نوری با طول موج بلند‌تر که از نمونه ساطع می‌شود، جمع‌آوری شده و برای شکل‌گیری تصویر نمونه مورد استفاده قرار می‌گیرد. در بیشتر موارد، بخشی از سلول یا بافتی که می‌خواهیم آن را مورد بررسی قرار دهیم، طبیعتاً فلورسنت نیست، از این رو، باید قبل از شروع کار با میکروسکوپ، نمونه را با یک رنگ یا برچسب فلورسنت نشان‌دار کنیم. رنگ‌های فلورسانسی نظیر رودامین و فلورسئين اغلب برای رنگ‌آمیزی سلول‌ها و اجزای داخلی آن‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند.

میکروسکوپ ماورا بنفش (Ultra Violet Microscopy)

در این نوع میکروسکوپ از نور ماروا بنفش به جای منبع نور مرئی استفاده می‌شود و به دلیل طول موج کوتاه و پر قدرت نور UV این نوع میکروسکوپ‌ها قدرت تفکیک بالایی دارند. از طرفی دیگر به دلیل مضر بودن این نور برای چشم، اغلب بعد از تصویربرداری از نمونه، تصاویر حاصل مشاهده می‌شود و در حین تصویربرداری کاربر به صورت مستقیم به آن‌ها نگاه نمی‌کند.

میکروسکوپ الکترونی (Electron Microscope)

این میکروسکوپ به جای استفاده از نور از الکترون ها بهره می گیرد.

الکترون ها عالی عمل می کنند؛ چرا که طول موج های کوتاه تری دارند.

درنتیجه این امکان را می دهند که اجسام خیلی نزدیک به هم را نیز تفکیک کنند.

میکروسکوپ های الکترونی وضوح بالاتری دارند، یعنی می توانند اجسام را در فاصله 1 نانومتری از هم متمایز کنند.

ما در این میکروسکوپ ها از لنز چشمی استفاده نمی کنیم.

همچنین قادر به تهیه تصاویری با جزئیات بالا از ساختارهای سطحی هستند.

بزرگ نمایی فوق العاده زیادی دارند که تا 200 هزار برابر می باشد.

این میکروسکوپ دارای کیفیت سه بعدی نیز هست.

به میکروسکوپ الکترونی یک کامپیوتر متصل است که تصویر را ایجاد می کند و به ما می گوید که چقدر الکترون توسط بخش های مختلف نمونه جذب شده است و در نهایت تصویر بر روی کامپیوتر ظاهر می شود.

اولین میکروسکوپ الکترونی، میکروسکوپ اسکنینگ (Scanning Electron Microscopes) یا SEM بود. میکروسکوپ های SEM محدودیت هایی نیز دارند که به شرح زیر است:

• گران قیمت هستند.
• کار با این میکروسکوپ ها آموزش های بسیار زیادی نیاز دارد.
• نمونه هایی که برای این میکروسکوپ استفاده می شود نباید زنده باشند و حتماً باید از نمونه های مرده استفاده شود؛ زیرا که الکترون باید از یک فضای خالی عبور کند.
• رنگ هایی که در این میکروسکوپ استفاده می شوند،
• حاوی فلزات سنگین هستند که به طور معمول سمی می باشند.
• تصاویری که ایجاد می شود سیاه و سفید هستند و در نتیجه ما قادر به ارائه صحیحی از رنگ نمونه ها نمی باشیم و مجبوریم رنگ آن ها را حدس بزنیم.

میکروسکوپ الکترونی روبشی

در میکروسکوپ الکترونی روبشی یا نگاره (Scanning Electron Microscopy)  که به اختصار به آن میکروسکوپ SEM می‌گویند، یک پرتو الکترون در سطح سلول یا بافت به جلو و عقب حرکت می‌کند و تصویری دقیق از سطح سه بعدی نمونه ایجاد می‌کند.

میکروسکوپ الکترونی روبشی نوعی میکروسکوپ الکترونی است که با اسکن سطح با پرتوهای متمرکز الکترونی، تصاویری از نمونه را تولید می‌کند. الکترون‌ها با اتم‌های موجود در نمونه تعامل دارند و سیگنال‌های مختلفی ایجاد می‌کنند که حاوی اطلاعاتی در مورد توپوگرافی سطح و ترکیب نمونه است. از این نوع میکروسکوپ برای گرفتن تصویر باکتری‌های سالمونلا که در بالا نشان داده شده است، استفاده می‌شود. این نوع میکروسکوپ‌ها دارای قدرت بزرگنمایی به اندازه ۵۰۰٫۰۰۰ برابر هستند و قدرت تفکیکی در حدود ۱ تا ۲۰ نانومتر دارند.

میکروسکوپ الکترونی عبوری

در میکروسکوپ الکترونی عبوری (Transmission Electron Microscopy) یا (TEM)، برعکس میکروسکوپ SEM، نمونه قبل از تصویربرداری به برش‌‌های بسیار نازک (به عنوان مثال با استفاده از لبه برش الماس) برش داده می‌شود و پرتوی الکترون به جای اینکه از سطح آن عبور کند، از برش نمونه عبور می‌کند. نمونه‌هایی که برای تصویربرداری با میکروسکوپ الکترونی عبوری آماده می‌شوند، اغلب ضخامتی در حدود ۱۰۰ نانومتر دارند. TEM معمولا برای به دست آوردن تصاویر دقیق از ساختار‌های داخلی سلول‌‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.

تفاوت میکروسکوپ‌های الکترونی عبوری و روبشی

میکروسکوپ TEM و SEM در چگونگی عبور پرتو و اطلاعات بدست آمده از نمونه با یکدیگر تفاوت‌هایی دارند. میکروسکوپ روبشی تصویری از سطح نمونه تهیه می‌کند، در حالی میکروسکوپ عبوری از داخل نمونه تصویربرداری می‌کنند. قدرت تفکیک و بزرگنمایی در میکروسکوپ الکترونی عبوری از میکروسکوپ الکترونی روبشی بالاتر است.

پرتوهای الکترونی در میکروسکوپ الکترونی روبشی به صورت نقطه به نقطه سطح نمونه را اسکن می‌کنند، اما پرتوهای میکروسکوپ TEM به تمام نمونه برخورد کرده و از آن عبور می‌کنند. علاوه بر این موارد، آماده‌سازی نمونه برای میکروسکوپ SEM از میکروسکوپ TEM آسان‌تر است.

انواع میکروسکوپ بر اساس تعداد چشمی

در حال حاضر میکروسکوپ ها در انواع مختلف و با کاربری های متفاوتی طراحی و در بازار تولید تجهیزات آزمایشگاهی به فروش می رسند که بر اساس تعداد چشمی آن به سه دسته زیر تقسیم می شوند.

میکروسکوپ تک چشمی

در این مدل از میکروسکوپ به جهت داشتن یک عدسی، برای مشاهده نمونه فقط باید از یک چشم استفاده نمایید.

میکروسکوپ دو چشمی

در این میکروسکوپ با داشتن دو عدسی چشمی، میتوان با کمک هر دو چشم نمونه مطالعاتی را مشاهده نمایید.

میکروسکوپ سه چشمی

این مدل از میکروسکوپ نیز عملکردی همانند میکروسکوپ دو چشمی دارد با این تفاوت که با داشتن یک چشمی سوم بر روی هد، به انتفال تصویر بر روی دوربین میکروسکوپ کمک می کند.